Главная – Журналы – Сибирский лесной журнал 2014 номер 4

Четвертый номер «Сибирского лесного журнала» тематический, в нем представлены материалы первого Международного совещания-семинара «Молекулярная генетика в практике лесного хозяйства: состояние, проблемы и перспективы применения», состоявшегося в мае 2014 г. в Москве на базе Российского центра защиты леса при поддержке Федерального агентства лесного хозяйства.

В Москве 28-29 мая 2014 г. Российский центр защиты леса («Рослесозащита») при поддержке Федерального агентства лесного хозяйства (Рослесхоз) впервые провел международное генетическое совещание-семинар «Молекулярная генетика в практике лесного хозяйства: состояние, проблемы и перспективы применения» с привлечением широкого круга специалистов по лесной генетике, геномике и биотехнологии, хозяйственников-производственников, руководителей лесных федеральных агентств и академических институтов преимущественно Российской Федерации (РФ) и Беларуси.

Хвойные являются ключевыми видами бореальных экосистем. Полное секвенирование, сборка и аннотация генома хвойных позволят понять эволюцию этого очень непростого и древнего генома, имеющего гигантский размер, который, например, у лиственниц в 4 раза, а у сосен — в 7–9 раз превышает геном человека. Геномные исследования позволят получить важную информацию и разработать высокоинформативные молекулярно–генетические маркеры, такие как микросателлиты и однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs), которые могут быть эффективно использованы для определения происхождения древесины, изучения и мониторинга генетической изменчивости хвойных лесов, их адаптации к изменению климата и для создания селекционных и природоохранных программ.

Представлены результаты молекулярно-генетических исследований, выполненных сотрудниками Института леса Национальной академии наук Беларуси. Приведены примеры их практического использования в лесном хозяйстве Беларуси.

Разработаны три хлоропластных и один митохондриальный ДНК–маркеры для генотипирования сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour). По результатам генотипирования 60 деревьев из двух популяций два хлоропластных локуса оказались мономорфными и один — полиморфным с двумя аллелями. Таким образом, всего для хлоропластных локусов выявлено два гаплотипа. Для митохондриального маркера также выявлено два аллеля, или гаплотипа (митотипа).

Рассмотрены актуальные и нерешенные проблемы взаимосвязи генетических и селекционных исследований лесных древесных растений. В частности, анализируются недостатки изучения изоэнзимного и ДНК–полиморфизма. Обсуждаются задачи, направленные на объединение исследований лесных генетиков и селекционеров.

Рассмотрены основные результаты феногеографических исследований популяционно-хорологической структуры сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) на Русской равнине, в Южном Зауралье и возможные направления их применения в практике лесного хозяйства России. Даны рекомендации использовать получаемые в итоге этих исследований карты-схемы пространственного расположения популяций при разработке лесосеменного районирования вида. Предложена система лесоводственно-хозяйственных мероприятий по восстановлению генетической изменчивости и эволюционно-генетических процессов в популяциях.

Приведены результаты применения методов молекулярной генетики для анализа наличия фитопатогенов в лесных насаждениях и питомниках Российской Федерации, в том числе Ризины волнистой (Rhizina undulata Fr. 1815) и корневой губки (Heterobasidion annosum (Fr.) Breff 1889). Обсуждаются перспективы и преимущества использования ДНК–анализа для ранней диагностики заболеваний растений без выделения патогена в чистую культуру, сокращения сроков исследования, возможности проведения массовых обследований и др.

Рассмотрены перспективы диагностики болезней древесных растений современными методами молекулярной фитопатологии. Описан метагеномный подход, основанный на анализе комплекса возбудителей, включая непатогенную микрофлору. Предложено использование мультикопийных универсальных локусов, характеризующихся некоторыми преимуществами при определении таксономической принадлежности инфекционных агентов в ходе молекулярно-фитопатологического анализа.

Рассмотрены аспекты применения молекулярно-генетических методов в диагностике видового состава микромицетов в тканях насекомых с целью выяснения роли последних в качестве переносчиков возбудителей основных заболеваний древесных видов в лесных питомниках. Установлено, что насекомые являются одним из потенциальных факторов переноса и распространения ряда фитопатогенных грибов, в частности представителей родов Cladosporium и Alternaria.

Рассмотрены результаты цитологических, лесоводственно-селекционных исследований и ДНК-анализа полиплоидных тополей. У клонов тополя изучены продуктивность, числа хромосом, проведены подбор и тестирование микросателлитных локусов для генетической паспортизации посадочного материала. Исследование показало высокую эффективность диагностики видов, индивидуальных генотипов и клонов внутри видов и гибридов на основе генных маркеров полиморфизма микросателлитной ДНК.

На основе метода электрофоретического анализа изоферментов проведены исследования объектов постоянной лесосеменной базы сосны обыкновенной в Беларуси. Выявлено, что практически все проанализированные плюсовые насаждения, генетические резерваты, лесосеменные плантации I порядка, географические культуры и до 71.5 % лесосеменных плантаций II порядка сохраняют уровень средней гетерозиготности, характерный для сосны обыкновенной в Беларуси. Показано, что в ходе плантационного и популяционного семеноводства можно при повышении продуктивности создаваемых лесных культур обеспечить сохранение видового генофонда.

Проведен генетический анализ митохондриального (мтДНК) и хлоропластного (хпДНК) геномов 27 климатипов ели европейской в географических культурах (Чериковский лесхоз, Беларусь). Установлено, что проанализированные климатипы представлены бореальным и карпатским гаплотипами мтДНК. Первый из них встречается во всех регионах произрастания климатипов (Приуральский, Северо-Западный, Центральный, Прибалтийский, Белорусский, Юго-Западный), второй — только на территории Белорусского и Юго-Западного. Показано, что уровень полиморфизма хпДНК значительно выше по сравнению с мтДНК. Для ряда аллелей локусов хпДНК обнаружена клинальная изменчивость по частотам их встречаемости. Выявлено, что отдельные гаплотипы хпДНК ели европейской подобно гаплотипам мтДНК могут быть представлены как во всех регионах исследованной части ареала, так и на определенных его территориях.

На клоновых плантациях сосны Pinus sylvestris L. в Алтайском крае, включающих около 1.5 тыс. деревьев 118 клонов, осуществлена поэтапная паспортизация деревьев. Паспортизация осуществлялась в 3 этапа: 1) лесоводственный (предварительный), 2) фенетический (основной), 3) молекулярно-генетический (уточняющий). Точность фенетической паспортизации составила 97.1 %. Заключительный этап паспортизации осуществлялся с учетом выявленных «фенетических кластеров» внутри клонов. Внутри кластеров сопоставлялись одно- и многораметные (смешанные) образцы, которые при отсутствии ошибок в маркировке деревьев должны показывать идентичные результаты. Способ поэтапной паспортизации позволяет сократить затраты на применение дорогостоящих методов молекулярной генетики в несколько раз.

Сомаклональная изменчивость, возникающая в процессе культивирования микрорастений древесных растений in vitro, является потенциальным источником расширения генетического разнообразия. Для исследования отобраны 20 линий регенерантов клонов березы повислой и гибридной, отличающихся рядом морфологических особенностей и интенсивностью органогенеза. Для подтверждения сомаклональной природы изменчивости и составления генетических паспортов линий березы использовали набор из пяти праймеров. Среди образцов, полученных на основе клона гибридной березы (№ 52-84/8), изменения RAPD-спектров обнаружены по праймерам UBC-106 и UBC-254. Линии клона березы повислой (№ 6-161/3) различались по праймерам UBC-268 и UBC-154. По праймеру UBC-203 различий не выявлено.

В результате секвенирования ядерной ДНК сибирской лиственницы (Larix sibirica Ledeb.) и сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) с помощью высокопроизводительного секвенатора Illumina HiSeq2000 и последующей первичной обработки данных для лиственницы получено 2 906 977 265 высококачественных парноконцевых нуклеотидных сиквенсов (чтений) генома и просеквенировано (прочитано) 576 млрд пар нуклеотидных оснований (п. н. о.), что соответствует 48–кратной длине генома лиственницы (48Х покрытие), равного 12.03 млрд п. н. о., а для кедра получено 3 427 566 813 чтений генома (679 млрд п. н. о.), что соответствует 29–кратной длине (29Х покрытие) генома кедра (23.6 млрд п. н. о.). Этих данных пока недостаточно для полной сборки и аннотации данных геномов, но полученные нуклеотидные сиквенсы уже позволили обнаружить и разработать эффективные высокополиморфные молекулярно-генетические маркеры, микросателлитные локусы, необходимые для популяционно-генетических исследований и идентификации происхождения древесины. Также продолжаются исследования однонуклеотидных полиморфизмов (так называемых «снипов»). Кроме того, геномные исследования российских бореальных лесов и связанных с ними фитопатогенов позволят обнаружить биомаркеры для решения важных научных и хозяйственных задач по сохранению лесных генетических ресурсов и селекции более устойчивых к заболеваниям и неблагоприятным факторам среды пород с ускоренным ростом и улучшенной древесиной.

На основании анализа изменчивости изоферментных и микросателлитных локусов ядерной и хлоропластной ДНК получены данные о степени дифференциации ряда популяций ели сибирской (Picea obovata Ledeb.), включая изолированные популяции, расположенные на о-ве Ольхон, в заповеднике Богд–Уул (Монголия) и на юге Магаданской области. Показано, что совместное использование разных типов генетических маркеров дает возможность получить более полную и объективную информацию о генетическом разнообразии и внутривидовой дифференциации этого широко распространенного в Сибири вида.

Исследование внутривидовой генетической дифференциации лиственницы Каяндера (Larix cajanderi) с помощью восьми ядерных микросателлитных локусов проведено на северо-востоке Азии — в Магаданской области и на п-ове Камчатка. SSR-анализ выявил высокий уровень генетического разнообразия. Значительные генетические различия между выборками из Магаданской области и Камчатки указывают на раннюю изоляцию лиственницы на полуострове.

Исследовано влияние величины выборки на результаты оценок генетического разнообразия популяций сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) по изменчивости 12 полиморфных локусов изоферментов и четырех микросателлитных локусов (cpSSR). Установлено, что увеличение выборки до 100 деревьев и более на популяцию приводит к существенному увеличению показателей как аллозимного разнообразия (по числу аллелей и генотипов), так и разнообразия гаплотипов хлоропластной ДНК (микросателлитных локусов cpSSR), к сокращению межпопуляционных генетических дистанций Nei без существенного изменения параметров, характеризующих генетическую структуру вида. Cтандартные объемы выборок позволяют адекватно оценить популяционную генетическую структуру вида, но недостаточны для изучения его внутрипопуляционного разнообразия.

Методом RAPD исследованы генетическая изменчивость и дифференциация 10 популяций лиственниц Камчатки, Сахалина и Курил. На основе анализа 319 RAPD локусов, полученных с использованием девяти произвольных праймеров, показано, что камчатские выборки характеризуются более высокими показателями генетической изменчивости (H_e = 0.172, P₉₅ = 43.0 %) по сравнению с сахалинскими и итурупскими выборками (H_e = 0.142, P₉₅ = 39.5 % и H_e = 0.143, P₉₅ = 41.1 % соответственно). Выявлена значительная генетическая подразделенность популяций лиственниц Сахалина (G_ST = 0.24) и Камчатки (G_ST = 0.25). Обнаружена достоверная корреляция генетических и географических дистанций между выборками (r = 0.68, p < 0.005).